Den Pilzen auf der Spur: Neue Methoden zur Enthüllung der Geheimnisse von Hefen, Bakterien und Schimmelpilzen
Yulia Efanova, Dr. Theresa Farr, Dr. Martin Pour Nikfardjam
Analytik
Die Prüfung der Qualität und Gesundheit des Lesegutes ist eine der wichtigsten Aufgaben der Analytik. Die Entwicklung neuer Methoden ist die Grundlage der Qualitätsüberwachung, die den aktuellen Fragestellungen gerecht wird. Der Klimawandel hat viele Themen in den Vordergrund gerückt, die bisher im Anbaugebiet Württemberg weniger Relevanz besaßen. Ein solches Thema ist zum Beispiel die Anwesenheit des Mykotoxins Ochratoxin A in der Traubenmaische oder im Wein.
Ochratoxin A ist ein sekundäres Stoffwechselprodukt von Schimmelpilzen der Gattungen Aspergillus und Penicillium, welche auch im Weinberg zu finden sind. Dieses Mykotoxin ist nephrotoxisch, neurotoxisch, teratogen und möglicherweise auch karzinogen. Eine solche gesundheitsschädliche Substanz ist in Lebensmitteln unerwünscht, es existiert ein EU-weiter Grenzwert von 2,0 μg/kg für Wein, Traubensaft und Traubenmost.
Am meisten betroffen von Ochratoxin A sind südliche Regionen mit warmen Klima. So liegt die Kontamination der Weine in Südeuropa bei 72,3% und in Nordeuropa bei 50,3% laut der letzten Einschätzung durch die Europäische Kommission. Der Grund dafür ist die Vorliebe der Ochratoxin A produzierenden Schimmelpilze für erhöhte Temperaturen. Das Optimum für das Schimmelpilz-Wachstum liegt zwischen 30 und 35 ⁰C. Der Klimawandel sorgt für allgemein wärmere Sommer in Deutschland, und die steigenden Temperaturen in den letzten Jahren machen klar, dass das Problem der Ochratoxin A-Belastung auch im Anbaugebiet Württemberg an Relevanz gewinnen wird. Die Entwicklung einer schnellen, robusten und kostengünstigen Analysemethode war daher nötig.
Die entwickelte Nachweismethode besteht aus der Extraktion mittels QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, and Safe) -Methode, einer chromatographischen Trennung mittels UHPLC und der Detektion mittels Fluoreszenz. In dem Extraktionsschritt werden zu 5 g Probe 5 mL destilliertes Wasser und 10 mL Acetonitril zugegeben. Als nächstes werden 1 g Natriumchlorid und 4 g Magnesiumsulfat hinzugefügt. Dieser Schritt ist nötig, um den Aussalz-Effekt zu erzeugen, wobei die wasserlöslichen Substanzen (inklusive Ochratoxin A) aus der wässrigen Phase verdrängt werden. Nach Schütteln und Abzentrifugieren wird die abgenommene organische Phase wieder mit Magnesiumsulfat versetzt, und die Lösung wird erneut geschüttelt und abzentrifugiert. Die Lösung wird mit Spritzenvorsatzfilter filtriert und 1:1 mit Methanol verdünnt. Die gesamte Extraktion dauert nur circa 30 Minuten und kann bei Bedarf auf mehrere Proben gleichzeitig erweitert werden, was die Methode sehr effizient macht. Die aufgearbeitete Probe wird mittels UHPLC chromatographisch getrennt und Ochratoxin A mittels Fluoreszenz-Detektion nachgewiesen. Die verwendeten Wellenlängen sind 333 nm für Extinktion und 460 nm für Emission.
Abbildung 1: Chromatogramme von Ochratoxin A im Weiß- und Rotwein
Die entwickelte Methode erlaubt es, Ochratoxin A als Zusatz-Qualitätsparameter zu analysieren. Zurzeit wird die Qualität und Gesundheit des Leseguts mit Hilfe von Nahinfrarotspektren auf Basis des LVWO-Index bestimmt, der die Überprüfung von vier Parametern beinhaltet: Gluconsäure, Glycerin, Essigsäure und Ergosterin. Ergosterin gilt dabei das größte Interesse, denn dieses dient als Indikator für Fäule. Da Ochratoxin A von Schimmelpilzen produziert wird, stellte sich die Frage, ob es eine Korrelation zwischen Ergosterin-Konzentration und Ochratoxin A besteht. Um dies zu überprüfen, wurden 71 Maische-Proben von regionalen Winzern vermessen, in denen Ergosterin und Ochratoxin A bestimmt wurden. Die Untersuchungen ergaben, dass laut Ergosterin-Konzentration elf Proben Fäulnis aufwiesen und drei Proben zusätzlich mit Ochratoxin A belastet waren.
| Lemberger | Cabernet Sauvignon | Grauburgunder | |
| Ochratoxin A [μg/kg] | 0,18 | 0,21 | 0,33 |
| Ergosterin [mg/kg] | 2,07 | 4,82 | 6,62 |
Tabelle 1: Ergebnisse der drei Proben mit Ochratoxin A Befund
Dabei war der Fäulnisbefall bei diesen Proben sehr unterschiedlich: Eine Probe hatte keine auffälligen Ergosterin-Werte, die zweite Probe war leicht von Fäulnis betroffen und die letzte Probe extrem faul. Die Konzentration von Ochratoxin A hat den gesetzlich festgelegten Grenzwert von 2,0 μg/kg jedoch nie überschritten.
Zusammenfassend kann man sagen, dass das geprüfte Lesegut von einer sehr guten Qualität war und es aus diesem Grund nicht möglich war, eine statistisch abgesicherte Korrelation zwischen Ergosterin und Ochratoxin A herzustellen. Daher sind Untersuchungen weiterer Proben unbedingt notwendig sowie eine Beobachtung der allgemeinen Situation, um aussagekräftige Ergebnisse zu generieren. Die entwickelte Methode erlaubt eine frühzeitige und kostengünstige Detektion und Quantifizierung von Ochratoxin A in Traubenmaische und Weinen.
Mikrobiologie
Die klassische Ausstattung für ein Mikrobiologie-Labor im Bereich Lebensmittel besteht aus Mikroskopen zur optischen Untersuchung der Zellen und Materialien, um Kulturen steril zu kultivieren. Was wir unter dem Mikroskop sehen können, sind meist ovale oder stäbchenförmige Zellen unterschiedlicher Größe. Auf den Agar-Platten kann man nach einigen Tagen einzelne meist weiße bis cremefarbene Kolonien sehen. Die Bestimmung, um welche Hefe oder Bakterium es sich handelt, wird hingegen schon schwieriger. Leider verraten uns diese Ergebnisse nur in den seltensten Fällen oder mit sehr großer Erfahrung, was wirklich drinsteckt, also: Welche Hefe- oder Bakterien-Art wir hier vor uns sehen oder aus unserer Gärung isoliert haben. Oftmals sind aber genau diese Fragen von Interesse.
In Zeiten, in denen Spontangärungen zum Standard-Repertoire der Winzer und Winzerinnen gehören und immer öfter die gezielte Vergärung mit Nicht-Saccharomyceten Hefen diskutiert und getestet wird (Vejarano und Gil-Calderón 2021), ist es durchaus relevant, mehr Informationen über die in den Gärungen vorhandenen Hefen zu erhalten. Eine Möglichkeit bietet eine einfache aber sehr wirkungsvolle Neuerung in unserem Labor: ein sogenanntes Differential-Medium, das einen Farbstoff enthält, der von unterschiedlichen Hefe-Arten verschieden aufgenommen wird (Abb. 2). Mit Hilfe dieses Wallerstein Differential-Agars können so auf einen Blick Hefe-Kolonien anhand ihrer Farbe unterschieden werden (Green and Gray, 1950).
Was aber, wenn die optische Differenzierung nicht ausreicht und man mehr Information über die isolierten Hefen benötigt? In den letzten 40 Jahren hat sich das Feld der Molekularbiologie rasant weiterentwickelt und bietet seit Erfindung der PCR und weiteren molekulargenetischen Methoden nicht mehr nur die Möglichkeit, nur optisch auf die Zellen zu schauen, sondern auch in sie hinein und
ihre Gene zu untersuchen. Für Labordiagnostik und in der Forschung sind diese Methoden mittlerweile absoluter Standard.
Mit dem Bezug des neuen Labors der Analytik bestand die Möglichkeit, dass das Mikrobiologie-Labor auch komplett für molekularbiologische Arbeiten ausgestattet werden konnte und somit methodisch neue Wege beschreiten kann. So startete das Jahr 2022 mit einem neuen Labor und neuen Geräten, für die zunächst Methoden aufgesetzt und etabliert werden mussten. Im ersten Quartal etablierten wir Methoden zur DNA-Isolation aus Hefezellen und erste PCR-Protokolle zur Identifizierung, oftmals mit sehr großzügiger Hilfe und Unterstützung unserer Nachbarn Martin Seidel und Prof. Dr. Brysch-Herzberg von der Hochschule Heilbronn. Von Mai bis November arbeitete Githa Ravikumar, eine Studentin des Masters Crop Sciences der Uni Hohenheim als Praktikantin im Labor, die bei der Etablierung unterschiedlicher Methoden zur Identifizierung (sogenanntes „fingerprinting“) von Hefen unterstützte, und natürlich hat sich auch die langjährige Mitarbeiterin der Mikrobiologie, Annette Klenk, schnell in die neuen Methoden eingearbeitet. Im Herbst 2022 konnten all die neuen Methoden direkt in einem Versuch angewendet werden, welcher im Folgenden genauer beschrieben wird.
Die Umstellung des Außenbetriebs Burg Wildeck auf ökologische Bewirtschaftung wirft spannende neue Themen auf, unter anderem die Frage, wie sich das Mikrobiom, welches die Pflanze und den Boden besiedelt, durch die angepasste Bewirtschaftung verändert. Diese Frage ist leider zu komplex, um sie „einfach“ beantworten zu können. Gerade das Mikrobiom des Bodens und das Zusammenspiel der Organismen gibt auch noch nach Jahren der Forschung Rätsel auf (Tkacz und Poole 2021; Guseva et al. 2022). Eine Frage, die jedoch uns und die Winzer und Winzerinnen interessiert, ist: Wird die Umstellung auch einen Einfluss das auf das Produkt Wein haben?
Spontangärungen sind mittlerweile in der Praxis etabliert und es ist weithin bekannt, dass die Hefen, die die Beerenhaut besiedeln, eine zentrale Rolle beim Start der Gärung und der Ausbildung der Aromen spielen (Pretorius 2000; Navarrete-Bolaños 2012). Mikrobiologische Gemeinschaften sind sehr komplexe Systeme (Zuñiga et al. 2017), daher erfolgte als erster Schritt in diesem Jahr eine Erfassung des Ist-Zustands in Form von Spontangärungen, die im Labormaßstab durchgeführt wurden. Über einen Monat wurden regelmäßig Proben genommen, der Gärverlauf wurde über FTIR-Messungen verfolgt und Verdünnungen wurden auf Differentialmedium ausplattiert, anschließend wurden die Kolonien morphologisch klassifiziert und gezählt (Abb. 3 A+B).
Um herauszufinden um welche Hefe-Arten es sich handelt, wurde nachfolgend die DNA isoliert und über unterschiedliche PCR-Methoden untersucht. Das sogenannte fingerprinting (Abb. 3 C), bekannt aus der Kriminalistik oder vom Vaterschaftstest, dient der Unterscheidung der unterschiedlichen Stämme. Daraufhin wurden per PCR kleine Fragmente aus der ribosomalen RNA amplifiziert, die hochvariabel und somit für die taxonomische Zuordnung von Pilzen geeignet sind (Methodensammlung der Bund/Länder-Arbeitsgemeinschaft Gentechnik 2011). In einem externen Labor werden diese Fragmente sequenziert und die Ergebnisse anschließend mit einer Datenbank abgeglichen (Abb. 3 D). Durch Isolation und Identifikation der Hefen könnte so in den folgenden Jahren eine Veränderung der Zusammensetzung der Organismen in Spontangärungen festgestellt werden (wobei der Einfluss von Witterung etc. auch nicht vernachlässigbar ist).
Die gezielte Beimpfung von Nicht-Saccharomyceten als sog. Bioprotektion gewinnt an Popularität, um die Vorteile der Spontangärung zu nutzen, die Risiken aber zu minimieren. Hierbei könnten zukünftig auch in diesem Versuch isolierte und identifizierte Hefen genutzt werden.
Abb. 3. Proben aus den Spontangärungen wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten auf Differentialmedium ausplattiert. Die Kolonien lassen sich deutlich anhand der Farbe und Oberfläche unterscheiden (A). Exemplarisch werden hier vier isolierte Kolonien gezeigt. Auf Grund der Kolonie-Morphologie kann man annehmen, dass es sich hier um drei unterschiedliche Hefearten handelt (B). Die genetische Analyse zeigt ebenso unterschiedliche Bandenmuster, was auf verschiedene Genotypen schließen lässt (C, M13 fingerprinting PCR). Die Sequenzierung ribosomaler Abschnitte (D1/D2-Locus amplifiziert mit NL1/NL4) ergab unterschiedliche Nukleotidsequenzen, die mit Hilfe des BLAST-tools drei unterschiedlichen Hefearten zugeordnet werden konnten.
Das Projekt Mikrobiom-Monitoring in Öko-Rebflächen wird gemeinsam mit Jochen Konradi und Johannes Wolf bearbeitet und freundlicherweise gefördert durch das MLR. Diese Finanzierung ermöglichte den Kauf wichtiger Laborgeräte. Dank bei der Durchführung des Versuchs 2022 gilt auch Lisa-Marie Blatt und Marius Beiermeister für die Unterstützung.
Literaturverzeichnis
Analytik
Brera, C.; Debegnach, F.; Minardi, V.; Prantera, E.; Pannunzi, E.; Faleo, S. et al. (2008). Ochratoxin A contamination in italian wine samples and evaluation of the exposure in the italian population. Journal of agricultural and food chemistry 56(22), 10611-10618. https://doi.org/10.1021/jf8016282
Commission Regulation (EC) No 1881/2006 of 19 December 2006 setting maximum levels for certain contaminants in foodstuffs. Available online: https://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/TXT/PDF/?uri=CELEX:32006R1881&from=EN (accessed on 14 September 2022)
Miraglia M., Brera C. Assessment of Dietary Intake of Ochratoxin A by the Population of EU Member States. European Commission; Brussels, Belgium; Luxembourg, Luxembourg: 2002. p. 153. SCOOP Reports on Tasks for Scientific Cooperation TASK 3.2.7.
Gil-Serna, J.; Vázquez, C.; González-Jaén, M.; Patiño, B. (2018). Wine Contamination with Ochratoxins: A Review. Beverages 4(1) 6. https://doi.org/10.3390/beverages4010006.
Chiotta, M. L., Ponsone, M. L., Sosa, D. M., Combina, M., & Chulze, S. N. (2013). Biodiversity of Aspergillus section Nigri populations in Argentinian vineyards and ochratoxin A contamination. Food Microbiology, 36(2), 182–190. https://doi.org/10.1016/J.FM.2013.04.003
Porep, J. U., Walter, R., Kortekamp, A., & Carle, R. (2014). Ergosterol as an objective indicator for grape rot and fungal biomass in grapes. Food Control, 37, 77–84. https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2013.09.012
Zhang, B., Chen, X., Han, S. Y., Li, M., Ma, T. Z., Sheng, W. J., & Zhu, X. (2018). Simultaneous analysis of 20 mycotoxins in grapes and wines from Hexi Corridor region (China): Based on a QuEChERS–UHPLC–MS/MS method. Molecules, 23(8). https://doi.org/10.3390/molecules23081926
Mikrobiologie
Guseva, Ksenia; Darcy, Sean; Simon, Eva; Alteio, Lauren V.; Montesinos-Navarro, Alicia; Kaiser, Christina (2022): From diversity to complexity: Microbial networks in soils. In: Soil biology & biochemistry 169, S. 108604. DOI: 10.1016/j.soilbio.2022.108604.
Green SR and Gray PP (1950): Paper read at the American Society of Brewing Chemists Meeting. Wallerstein Laboratories Communications. Vol 12, Page 43.
Navarrete-Bolaños, José Luis (2012): Improving traditional fermented beverages: How to evolve from spontaneous to directed fermentation. In: Eng. Life Sci. 12 (4), S. 410–418. DOI: 10.1002/elsc.201100128.
Pretorius, Isak S. (2000): Tailoring wine yeast for the new millennium: novel approaches to the ancient art of winemaking. In: Yeast 16 (8), S. 675–729. DOI: 10.1002/1097-0061(20000615)16:8<675::AID-YEA585>3.0.CO;2-B.
Tkacz, Andrzej; Poole, Philip (2021): The plant microbiome: The dark and dirty secrets of plant growth. In: Plants People Planet 3 (2), S. 124–129. DOI: 10.1002/ppp3.10167.
Vejarano, Ricardo; Gil-Calderón, Angie (2021): Commercially Available Non-Saccharomyces Yeasts for Winemaking: Current Market, Advantages over Saccharomyces, Biocompatibility, and Safety. In: Fermentation 7 (3), S. 171. DOI: 10.3390/fermentation7030171.
Zuñiga, Cristal; Zaramela, Livia; Zengler, Karsten (2017): Elucidation of complexity and prediction of interactions in microbial communities. In: Microbial biotechnology 10 (6), S. 1500–1522. DOI: 10.1111/1751-7915.12855.
Methodensammlung der Bund/Länder-Arbeitsgemeinschaft Gentechnik (LAG) (2011): Molekularbiologische Identifizierung von Pilzen mittels ITS-PCR und nachfolgender Sequenzierung (AM028). Online im Internet, https://www.lag-gentechnik.de/dokumente/uam-methoden/028.pdf (03/2011), Abfrage 19.01.2023.