Das Mikrobiom-Monitoring Projekt der LVWO Weinsberg

Das pflanzliche Mikrobiom umfasst alle in und auf der Pflanze sowie im Boden befindlichen Mikroorganismen (Phyllosphäre, Endosphäre, Rhizosphäre). Auch wenn Mikroorganismen oftmals hauptsächlich als Krankheitserreger bekannt sind, gibt es viele Arten, die sich positiv auf Gesundheit, Nährstoffaufnahme und Stressresistenz der Pflanzen auswirken. Im Weinbau beeinflussen sie Traubenqualität, Aroma- und Weininhaltstoffzusammensetzung. Die ökologische Bewirtschaftung steigert mikrobielle Diversität durch reduzierten Pflanzenschutzeinsatz, was Nährstoffdynamik, Ökosystemstabilität und Pflanzenresilienz verbessert (RESOLUTION OIV-VITI 655-2021).

Das „Mikrobiom-Projekt“ an der Burg Wildeck

Im Jahr 2021 wurde das Projekt im Zuge der Umstellung der Flächenbewirtschaftung an der Burg Wildeck (Abstatt) von integrierter auf ökologische Bewirtschaftung initiiert. Im Rahmen der Einrichtung eines molekularbiologischen Labors im neuen Laborgebäude des Referats Analytik wurde mit Unterstützung des MLR ein Projekt gestartet, das die Anschaffung mehrerer Laborgeräte sowie ein Budget für Mikrobiom-Sequenzierungen ermöglichte (vgl. Jahresbericht 2022).

Fragestellung

Welche Veränderungen lassen sich im Mikrobiom der Weinrebe beobachten, wenn die Bewirtschaftung von integriert auf ökologisch umgestellt wird?

Untersucht wurden das Mikrobiom der Phyllosphäre und Endosphäre von Beeren und Blättern von Chardonnay-Rebstöcken.

Methode

Proben wurden in den Jahren 2021, 2022, 2023 und 2025 im Chardonnay Beet 840 (ehemals 820) am Standort Burg Wildeck (Abstatt) gesammelt. Dabei wurden jeweils von denselben Rebstöcken Proben von Beeren und Blättern genommen. Für jeden Probentyp wurden jeweils 3 Replikate pro Rebzeile einzeln steril gesammelt und in sterilen Gefäßen bei -20 °C gelagert. Zur Mikrobiom-Analyse wurden die Proben wie folgt aufgearbeitet: Beeren: 1-2 Beerenhäute (je nach Größe der Beere, Gewicht ca. 1,3 g), Blatt: kleine Stücke von mehreren Blättern pro Replikat, Gewicht 0,25 g. Die Proben wurden jeweils in einem 15 ml Reaktionsgefäß in 5 ml DNA/RNA shield (Zymo Research) bei Raumtemperatur an Zymo Research (Freiburg) versendet.

Folgende Methoden wurden von Zymo Research (Freiburg) durchgeführt: DNA-Extraktion aus zerkleinertem Probenmaterial, PCR-Amplifikation: 16S rRNA (V3–V4, Bakterien), ITS2 (Pilze). Bibliotheken-Pooling, Illumina NextSeq™-Sequenzierung (2 × 300 bp). Bioinformatik.

Die Auswertung der Sequenzierdaten zur Erstellung von Bar plots, die aus den Mittelwerten der jeweils drei Replikate gebildet wurden, wurden von T. Farr durchgeführt.

 

Im Januar 2022 wurde erstmalig eine 16S/ITS-Sequenzierung in Auftrag gegeben und die Proben von 2021 wurden auf ihre mikrobielle Komposition untersucht. Daraufhin wurden in den folgenden Jahren (2022, 2023, 2025) 1-2 Tage vor der Lese des Beetes 820/840 Proben genommen und eingefroren bei -20°C gelagert, bis im Dezember 2025 die Proben von 2022-2025 gemeinsam zur Analyse vorbereitet und versendet wurden. Für die bioinformatische Auswertung der Proben wurden die 2022 generierten Rohdaten miteinbezogen, somit sind die Proben miteinander vergleichbar. Die Ergebnisse der Bodenproben (nur 2021) wiesen eine sehr hohe Diversität auf, worauf entschieden wurde nur das Mikrobiom der Beerenhäute und Blattoberflächen zu untersuchen. Zur Demonstration wurden die Ergebnisse der Bodenproben nicht aus den Barplots entfernt (Abb. 1 + 2). Ebenso werden als „pool samples“ bezeichnete Proben gezeigt (Abb. 1 + 2), die jeweils aus den drei Einzelreplikaten zusammengestellt wurden. Diese Proben wurden in keine weitere Auswertung mit einbezogen.

Ein Teil der Fragestellung war es den momentanen Status quo des Mikrobioms des Weinbergs zu untersuchen. Zusätzlich dient die erste Probennahme 2021 als Kontrolle, da es sich um den Ausgangszustand unter integrierter Bewirtschaftung handelt. Offen war die Frage, ob sich der Wechsel von integrierter auf ökologische Bewirtschaftung auch eine Veränderung des Mikrobioms zeigt. Entgegen der ursprünglichen Planung, dass zuerst nur ein Teil der Lagen auf eine Bewirtschaftung nach den Richtlinien des biologischen Landbaus (EU-Öko-Richtlinien) umgestellt wird und so permanent eine parallele Kontrolle im Vergleich zur integrierten Bewirtschaftung stattfinden kann, erfolgte eine komplette Umstellung des Standorts Burg Wildeck auf ökologischen Landbau. Dies bedeutet, dass eine direkte Kontrolle zu den Proben fehlt, die denselben jährlichen Wetterereignissen und Klimabedingungen ausgesetzt war (vgl. van Rijssel et al., 2022).

Herausforderungen des Projekts

Bei diesem Versuchsaufbau liegt die zentrale Schwierigkeit darin, Veränderungen im Mikrobiom eindeutig der Umstellung auf ökologische Bewirtschaftung zuzuordnen. Das System Weinberg ist ein offenes Freilandökosystem, in dem sich zahlreiche Einflussfaktoren, besonders die sich jährlich verändernden klimatischen Bedingungen direkt auswirken. Weitere Faktoren wie leicht wechselnde Stellen der Probenahme, Unterschiede in Beerengröße und auch die teilweise lange Lagerdauer der Proben bei -20 °C können zusätzliche Variation in die Daten bringen. Diese Faktoren erschweren direkte Vergleiche zwischen den Jahren und können dazu führen, dass echte Managementeffekte statistisch nur schwer von zufälliger oder witterungsbedingter Streuung zu trennen sind. Da eine echte Kontrolle für die Jahre 2022-2025 fehlt, sind die Ergebnisse der Untersuchungen nur bedingt belastbar.

Ergebnisse & Diskussion

Die Auswertung der Mikrobiom-Daten erlaubt, wie bereits erörtert, keine generellen Aussagen zur Auswirkung des Flächenmanagements auf das Mikrobiom. Analog zu vielen wissenschaftlichen Studien konnte auch in dieser Arbeit gezeigt werden, dass ein Wechsel von integrierter zu ökologischer Bewirtschaftung nicht zwangsläufig eine Zunahme der Artenzahl bewirkt, sondern vor allem Verschiebungen in der mikrobiellen Zusammensetzung, so dass einzelne Arten innerhalb der Community häufiger auftreten (van Rijssel et al., 2022, Colautti et al., 2023). Es ist damit zu rechnen, dass im zeitlichen Verlauf der Anteil nützlicher Mikroorganismen weiter steigen wird. Der Zeitraum von 5 Jahren ist jedoch zu kurz, um hier bereits klare Tendenzen sehen zu können. Es wäre sinnvoll, diese Untersuchung in einem größeren Zeitintervall noch einmal zu wiederholen, um Langzeiteffekte erkennen zu können.

Abb. 1: Darstellung der Alpha-Diversität der untersuchten Einzelproben. Es ist deutlich erkennbar, dass die Alpha-Diversität innerhalb der 5 Jahre des Untersuchungszeitraums nicht ansteigt. Die Alpha-Diversität der Bodenproben (soil) übersteigt die Zahl der Blätter- und Beeren deutlich. Zur besserer Übersichtlichkeit wurden die Bodenproben von weiteren Untersuchungen ausgeschlossen. Die Proben ohne Jahresangabe wurden 2021 genommen. Die Graphiken wurden von Zymo Research zur Verfüung gestellt.

 

Die Alpha-Diversität der Einzelproben zeigt über fünf Jahre keine systematische Zunahme und unterstreicht, dass die Managementumstellung allein keine „Artenexplosion" verursacht, sondern dass einzelne Spezies eine höhere Abundanz aufweisen können. Der Vergleich der Beta-Diversität zwischen dem Mikrobiom der Beerenhaut und der Blattoberflächen zeigt in der Regel keine auffälligen Ergebnisse, da diese sich besonders im Vergleich zur Diversität des Bodenmikrobioms wenig unterscheiden, zudem ist das Mikrobiom der Beeren und Blätter stark jahreszeitlich beeinflusst. Es ist jedoch deutlich zu erkennen, dass die Proben der Bodenanalysen von 2021 eine eigene Gruppe bilden und sich somit in ihrer Zusammensetzung stark von Beeren und Blättern unterscheiden (Abb. 2, rechts oben).

Abb. 2. Die Beta-Diversität stellt die Beziehungen der einzelnen Proben untereinander im dreidimensionalen Raum dar. Proben mit ähnlichen mikrobiellen Profilen liegen näher beieinander, während Proben mit unterschiedlicherer Mikrobiom-Zusammensatzung weiter voneinander entfernt sind. Die Bodenproben von 2021 bilden eine eigene Gruppe (markiert mit Kasten). Die Proben ohne Jahresangabe wurden 2021 genommen. Die Graphik wurde von Zymo Research zur Verfügung gestellt.

Interessante Einzelbefunde bei den Pilzen sind z.B. Aureobasidium sp. und Cladosporium sp. Bereits in den Proben, die 2021 genommen wurden, konnte der Pilz Aureobasidium pullulans identifiziert werden. Dieser hefeartige Pilz ist ein natürlicher Bewohner von Rebflächen, kann aber vermehrt in ökologisch bewirtschafteten Flächen nachgewiesen werden. Dieser Pilz gilt als Antagonist von pathogenen Pilzarten (Schmidt et al., 2011, Pinto et al., 2018). Der Schimmelpilz Cladosporium sp. ist nicht pathogen, kann aber durch Raumkonkurrenz andere Pathogene verdrängen und so als Nützling wirken. Auffällig war der hohe Anteil von Erysiphe necator, dem Erreger der Rebkrankheit Echter Mehltau auf den Blattoberflächen in den Jahren 2022 und 2023. Die Präsenz von E. necator kann auch in der Darstellung der Beta-Diversität nachvollzogen werden (vgl. Abb. 2).

 

Abb. 3+4. Darstellung der Zusammensetzung des Mikrobioms von Beerenhaut und Blattoberfläche der 50 häufigsten Taxa (Abb. 5, oben). Gezeigt sind die Ergebnisse der Sequenzierungen für den spezifischen Nachweis von Pilzen (ITS-PCR). Die Replikate wurden zu einem Mittelwert verrechnet und dann gegeneinander in einem bar plot aufgetragen. Dargestellt ist der prozentualen Anteile der Taxa auf Spezies-Ebene. Die 5 häufigsten Arten sind in Abb. 6 dargestellt (links). Gezeigt ist die relative Häufigkeit innerhalb der Probe (berechnet aus 3 Replikaten).

Bei den Bakterien konnte Vertreter wie Sphingomonas, Bacillus und Pseudomonas nachgewiesen werden, die häufig in Mikrobiomen der Phyllosphäre nachgewiesen werden (Bashir et al., 2022). Eine genauere Analyse der Taxa steht noch aus. Die Datenbank Zuordnung mit dem Rang 1 der meist detektierten reads bei der Sequenzierung ergibt die Pflanze Siparuna decipiens (decipiens – vinifera), wurde aber der Familie der Rickettsiales mit dem Hinweis Mitochondria (genus) zugeordnet. Diese Familie enthält endosymbiontische Bakterien, die meist obligat intrazellulär leben und das Genom weist Ähnlichkeiten mit der mitochondriellen DNA auf. Auf Grund der hohen Wahrscheinlichkeit eines falsch-positiven Ergebnisses wurde dieses Taxon nicht in die Auswertungen mit einbezogen.

Abb. 5. Darstellung der Zusammensetzung des Mikrobioms von Beerenhaut und Blattoberfläche der 49 häufigsten Taxa. Gezeigt sind die Ergebnisse der Sequenzierungen für den spezifischen Nachweis von Bakterien (16S-PCR). Die Replikate wurden zu einem Mittelwert verrechnet und dann gegeneinander in einem bar plot aufgetragen. Dargestellt ist der prozentualen Anteile der Taxa auf Spezies-Ebene.

Literatur

• Bashir, I., War, A. F., Rafiq, I., Reshi, Z. A., Rashid, I., Shouche, Y. S. (2022). Phyllosphere microbiome: Diversity and functions. Microbiological Research, 254, 126888. doi 10.1016/j.micres.2021.126888.
• Colautti A, Civilini M, Contin M, Celotti E and Iacumin L (2023) Organic vs. conventional: impact of cultivation treatments on the soil microbiota in the vineyard. Front. Microbiol. 14:1242267. doi: 10.3389/fmicb.2023.1242267.
• Pinto C, Custódio V, Nunes M, Songy A, Rabenoelina F, Courteaux B, Clément C, Gomes AC, Fontaine F. Understand the Potential Role of Aureobasidium pullulans, a Resident Microorganism From Grapevine, to Prevent the Infection Caused by Diplodia seriata. Front Microbiol. 2018 Dec 11;9:3047. doi 10.3389/fmicb.2018.03047.
• Schmid F, Moser G, Müller H, Berg G. Functional and structural microbial diversity in organic and conventional viticulture: organic farming benefits natural biocontrol agents. Appl Environ Microbiol. 2011 Mar;77(6):2188-91. doi: 10.1128/AEM.02187-10.
• van Rijssel, S. Q., Veen, G. F., Koorneef, G. J., Bakx-Schotman, J. M. T., ten Hooven, F. C., Geisen, S., & van der Putten, W. H. (2022). Soil microbial diversity and community composition during conversion from conventional to organic agriculture. Molecular Ecology, 31, 4017–4030. doi 10.1111/mec.16571.